визначення
Ферменти являють собою білки, вироблені в клітинах рослин і тварин, які діють як каталізатори шляхом прискорення біологічних реакцій без зміни.
Ферменти працюють, поєднуючись з певною речовиною, щоб перетворити її в іншу речовину; класичними прикладами є травні ферменти, що знаходяться в слині, в шлунку, в підшлунковій залозі і в тонкому кишечнику, які виконують важливу функцію в травленні і допомагають розщеплювати продукти в основні складові, які потім можуть бути поглинені і використані організмом., оброблені іншими ферментами або вигнаними як відходи.
Кожен фермент має певну роль: той, який розкладає жири, наприклад, не впливає на білки або вуглеводи. Ферменти є необхідними для благополуччя організму. Дефіцит, навіть одного ферменту, може викликати серйозні розлади. Досить відомим прикладом є фенілкетонурія (ФКУ), хвороба, що характеризується неможливістю метаболізувати незамінні амінокислоти, фенілаланін, накопичення яких може викликати фізичні деформації і психічні захворювання.
Біохімічний аналіз
Ферменти є конкретними білками, які мають властивість бути біологічними каталізаторами, тобто вони мають здатність знижувати енергію активації (Eatt) реакції, змінюючи свій шлях, щоб зробити кінетично повільний процес більш швидким.
Ферменти збільшують кінетику термодинамічно можливих реакцій і, на відміну від каталізаторів, більш-менш специфічні: вони, отже, мають субстратну специфічність.
Фермент не бере участь у стехіометрії реакції: для цього необхідно, щоб кінцевий каталітичний сайт був ідентичний вихідному.
У каталітичному дії майже завжди йде повільна фаза, що визначає швидкість процесу.
Якщо говорити про ферменти, то не варто говорити про рівноважні реакції, а про стаціонарний стан (стан, при якому певний метаболіт формується і споживається безперервно, зберігаючи його концентрацію майже постійною). Продукт реакції, що каталізується ферментом, зазвичай сам по собі є реагентом для наступної реакції, каталізується іншим ферментом тощо.
Ферментно-каталізовані процеси зазвичай складаються з послідовностей реакцій.
Таким чином, загальну реакцію, катализируемую ферментом (Е), можна схематизувати:
Родовий фермент (Е) об'єднує з субстратом (S) для формування аддукту (ES) з константою швидкості K1; він може знову дисоціювати в E + S, з константою швидкості K2, або (якщо «живе» досить довго), він може перейти до форми P з константою швидкості K3.
Продукт (Р) може, в свою чергу, рекомбінувати з ферментом і реформувати аддукт зі швидкістю константи К4.
Коли фермент і субстрат змішані, є частка часу, в якому зустріч між двома видами ще не відбулася: тобто існує надзвичайно короткий інтервал часу (який залежить від реакції), в якому фермент і субстрат ще не виконані; після цього періоду фермент і субстрат контактують у зростаючих кількостях і формується ES-аддукт. Згодом фермент діє на субстрат і продукт вивільняється. Потім можна сказати, що є початковий часовий інтервал, в якому концентрація аддукту ES не може бути визначена; після цього періоду передбачається встановлений стаціонарний стан, тобто швидкість процесів, що ведуть до аддукту, дорівнює швидкості процесів, що призводять до руйнування аддукту.
Константа Міхаеліса-Ментена (КМ) є константою рівноваги (згаданої вище першої рівноваги); можна сказати, з гарною апроксимацією (тому що K3 також слід враховувати), що КМ представлено співвідношенням кінетичних констант К2 і К1 (що відноситься до руйнування і утворення аддукту ЕС у першому рівновазі, описаному вище).
Через константу Міхаеліса-Ментена ми маємо вказівку на спорідненість між ферментом і субстратом: якщо КМ невелика, то існує висока спорідненість між ферментом і субстратом, тому ЕС аддукт є стабільним.
Ферменти підлягають регулюванню (або модуляції).
У минулому говорилося, перш за все, про негативну модуляцію, тобто про пригнічення каталітичних можливостей ферменту, але також можна мати позитивну модуляцію, тобто існують види, здатні підвищувати каталітичні можливості ферменту.
Існує 4 типи заборон (отриманих з наближень, зроблених на моделі для відповідності експериментальних даних з математичними рівняннями):
- конкурентне інгібування
- неконкурентне гальмування
- Некомпетентне гальмування
- конкурентне гальмування
Існує розмова про конкурентне інгібування, коли молекула (інгібітор) здатна конкурувати з субстратом. За структурної подібності інгібітор може реагувати замість субстрату; саме звідси походить термін "конкурентне гальмування". Імовірність того, що фермент зв'язується з інгібітором або субстратом, залежить від концентрації обох і їх афінності з ферментом; швидкість реакції залежить від цих факторів.
Для отримання такої ж швидкості реакції, яка мала б місце без присутності інгібітора, необхідно мати більш високу концентрацію субстрату.
Експериментально показано, що в присутності інгібітора постійно Міхаеліса-Ментена зростає.
Що стосується, навпаки, неконкурентного інгібування, взаємодія між молекулою, яка повинна працювати як модулятор (позитивний або негативний інгібітор) і фермент, відбувається в місці, яке відрізняється від того, в якому взаємодія між ферментом і субстратом; Тому ми говоримо про аллостеричну модуляцію (від грецького allosteros → інше місце).
Якщо інгібітор переходить на зв'язування з ферментом, він може індукувати модифікацію структури ферменту і, отже, він може знижувати ефективність, з якою субстрат зв'язується з ферментом.
У цьому типі процесу константа Міхаеліса-Ментена залишається постійною, оскільки ця величина залежить від рівноваги між ферментом і субстратом, і ці рівноваги, навіть у присутності інгібітора, не змінюються.
Явище некомпетентного гальмування зустрічається рідко; типовим некомпетентним інгібітором є речовина, що оборотно зв'язується з аддукцією ES, що призводить до появи ESI:
Інгібування надлишкового субстрату іноді може бути некомпетентним типом, оскільки це відбувається, коли друга молекула субстрату зв'язується з комплексом ES, даючи початок комплексу ESS.
З іншого боку, конкурентний інгібітор може зв'язуватися тільки з аддуктом ферменту субстрату, як і в попередньому випадку: зв'язування субстрату з вільним ферментом індукує конформаційну модифікацію, що робить сайт доступним для інгібітора.
Константа Міхаеліса Ментена зменшується зі збільшенням концентрації інгібітора: мабуть, таким чином, спорідненість ферменту до субстрату зростає.
Серинові протеази
Це сімейство ферментів, до яких належать хімотрипсин і трипсин.
Хімотрипсин - це протеолітичний і гідролітичний фермент, який праворуч ріже гідрофобні та ароматичні амінокислоти.
Продукт гена, який кодує хімотрипсин, неактивний (він активується командою); неактивна форма химотрипсина представлена поліпептидним ланцюгом з 245 амінокислот. Хімотрипсин має глобулярну форму за рахунок п'яти дисульфідних мостів та інших незначних взаємодій (електростатичні, ван-дер-ваальсові сили, водневі зв'язки і т.д.).
Хімотрипсин продукуються химатними клітинами підшлункової залози, де він міститься в спеціальних мембранах і виводиться через протоку підшлункової залози в кишечник, під час перетравлення їжі: хімотрипсин - це фактично травний фермент. Білки і поживні речовини, які ми вживаємо через дієту, піддаються перетравленню до менших ланцюгів і поглинаються і трансформуються в енергію (наприклад, амілази і протеази розщеплюють поживні речовини в глюкозу і амінокислоти, які досягають клітин, через кровоносні судини вони потрапляють у портальну вену і звідти переносяться до печінки, де вони піддаються подальшому лікуванню).
Ферменти виробляються в неактивній формі і активуються тільки тоді, коли вони досягають "місця, де вони повинні працювати"; коли їхня дія закінчується, вони деактивуються. Фермент, після дезактивації, не може бути реактивований: щоб мати додаткову каталітичну дію, його необхідно замінити іншою молекулою ферменту. Якщо хімітріпсин вже вироблявся в активній формі в підшлунковій залозі, він би напав на останнє: панкреатит - це патології через травні ферменти, які вже активовані в підшлунковій залозі (а не в потрібних місцях); деякі з них, якщо їх не лікувати вчасно, призводять до смерті.
У хімотрипсині і в усіх серинових протеазах каталітична дія відбувається за рахунок існування алкалового аніона (-CH2O-) в бічному ланцюзі серину.
Такі назви серинових протеаз приймають саме тому, що їх каталітична дія викликається серином.
Після того, як весь фермент здійснив свою дію, перед тим, як знову працювати на підкладці, він повинен бути відновлений водою; "вивільнення" серину водою є найповільнішою стадією процесу, і саме ця фаза визначає швидкість каталізу.
Каталітична дія відбувається у дві фази:
- формування аніонів з каталітичними властивостями (алкилат-аніон) і подальший нуклеофільний напад на карбонильний вуглець (C = O) з розщепленням пептидного зв'язку і утворення ефіру;
- напад води з відновленням каталізатора (здатний, таким чином, знову здійснювати його каталітичну дію).
Різні ферменти, що належать до сімейства серинових протеаз, можуть бути складені з різних амінокислот, але для всіх каталітичний сайт представлений алкановим аніоном бічного ланцюга серину.
Підсімейство серинових протеаз - це ферменти, що беруть участь у коагуляції (яка полягає у перетворенні білка, від їх неактивної форми до іншої активної форми). Ці ферменти гарантують, що коагуляція є максимально ефективною і обмежена в просторі і в часі (коагуляція повинна відбуватися швидко і повинна відбуватися тільки поблизу пошкодженої ділянки). Ферменти, що беруть участь у коагуляції, активуються в каскаді (від активації одного ферменту отримуються мільярди ферментів: кожен фермент активований, у свою чергу активує багато інших ферментів).
Тромбоз - це захворювання, що виникає внаслідок неправильного функціонування коагуляційних ферментів: це викликано активацією, без необхідності (через відсутність ураження) ферментів, що використовуються при коагуляції.
Існують модулюючі ферменти (регулятори) та інгібуючі ферменти для інших ферментів: взаємодіючи з останніми, вони регулюють або пригнічують їхню діяльність; навіть продукт ферменту може бути інгібітором ферменту. Є ще й ферменти, які працюють більше, чим більше присутній субстрат.
лізоцим
Луїджі Пастер виявив, випадково, чхаючи на чашці Петрі, що в слизу є фермент, здатний вбивати бактерії: лізоцим ; від грецької: liso = яка ріже; zimo = фермент.
Лізоцим здатний порушувати клітинну стінку бактерій. Бактерії та, загалом, одноклітинні організми потребують механічно стійких структур, що обмежують їх форму; всередині бактерій є дуже високий осмотичний тиск, тому вони притягують воду. Плазмова мембрана вибухнула б, якщо б не було клітинної стінки, яка б протистояла входу води і обмежувала обсяг бактерії.
Клітинна стінка складається з полісахаридного ланцюга, в якому чергуються молекули N-ацетил-глюкозаміну (NAG) і молекули N-ацетил-мурамової кислоти (NAM); зв'язок між NAG і NAM руйнується гідролізом. Карбоксильна група NAM в клітинній стінці залучена в пептидний зв'язок з амінокислотою.
Між різними ланцюгами утворюються мости, що складаються з псевдопептидних зв'язків: розгалуження обумовлено молекулою лізину; структура в цілому дуже розгалужена і це надає їй високу стабільність.
Лізоцим є антибіотиком (він вбиває бактерії): він діє шляхом створення тріщини в бактеріальній стінці; коли ця структура порушена (яка є механічно стійкою), бактерія притягує воду, поки вона не лопне. Лізоцим здатний розривати зв'язок b-1, 4 з глюкозидом між NAM і NAG.
Каталітичний сайт лізоциму представлений борозенкою, яка проходить уздовж ферменту, в який введена полісахаридна ланцюг: шість глюкозидних кілець ланцюга знаходять своє місце в борозенці.
У положенні 3 канавки є вузьке місце: в цьому положенні може бути розміщений тільки один NAG, тому що NAM, який є більшим, не може входити. Фактичний каталітичний сайт знаходиться між положеннями чотири і п'ять: існує NAG в положенні 3, розріз буде мати місце між NAM і NAG (а не навпаки); отже, розріз специфічний.
Оптимальним рН для функціонування лізоциму є п'ять. У каталітичному сайті ферменту, що знаходиться між позиціями чотири і п'ять, є бічні ланцюги аспарагінової кислоти і глутамінової кислоти.
Ступінь гомології : вимірює зв'язок (тобто подібність) між білковими структурами.
Існує жорсткий зв'язок між лізоцимом і лактозо-синтетазою.
Синтаза лактози синтезує лактозу (яка є основним цукром у молоці): лактоза - це галактозилглюкозид, в якому існує β-1, 4-глюкозидна зв'язок між галактозою та глюкозою.
Таким чином, лактоза синтетаза каталізує реакцію, протилежну тій, що каталізується лізоцимом (який замість цього розщеплює β-1, 4-глюкозидний зв'язок).
Синтаза лактози є димером, тобто складається з двох білкових ланцюгів, одна з яких має каталітичні властивості і порівнянна з лізоцимом, а інша є регуляторною субодиницею.
Під час вагітності глікопротеїни синтезуються з клітин молочної залози дією галатозил-трансферази (вона має 40% гомологію послідовності з лізоцимом): цей фермент здатний переносити галактозильную групу з високоенергетичної структури до структури глікопротеїну. Під час вагітності індукується експресія гена, що кодує галактоз-трансферазу (є також експресія інших генів, які також дають інші продукти): спостерігається збільшення розміру молочної залози, оскільки активована молочна залоза (раніше неактивні), які повинні виробляти молоко. Під час пологів виробляється α-лактаальбумін, який є регуляторним білком: він здатний регулювати каталітичну здатність галактозилтрансферази (через субстратну дискримінацію). Галактозил-трансфераза, модифікована α-лактаальбуміном, здатна переносити галактозил на молекулу глюкози: утворюючи β-1, 4 глікозидний зв'язок і даючи лактозу (лактоза синтетаза).
Таким чином, галактозотрансфераза готує молочну залозу перед доставкою і виробляє молоко після доставки.
Для отримання глікопротеїнів галактозилтрансфераза зв'язується з галактозилом і NAG; під час пологів лактальний альбумін зв'язується з галактозилтрансферазой, внаслідок чого остання розпізнає глюкозу, а не NAG, даючи лактозу.
